临床常见病原菌如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等均属于革兰氏阴性菌，其特殊的外膜成分是产生高致病性和高耐药性的关键。β-桶状蛋白 (Outer membrane proteins, OMPs) 是细菌外膜的主要蛋白成分，作为物质交换门户参与细菌膜稳定维持、宿主入侵与定植以及耐药等功能。β-桶蛋白三级结构的正确折叠是其发挥功能的重要条件：新生肽链在胞内合成后被运送到外膜由外膜β-桶蛋白整合机器(β-barrel assembly machinery，BAM) 帮助折叠成桶型结构并整合到外膜中。这一过程在细菌中非常保守，删除任何一个BAM亚基 (BamABCDE) 便可导致细菌死亡，因此被视为最具潜力的新型抗菌靶点。近年，针对BAM 结构功能的研究成为结构生物学的一个热点。研究发现BAM蛋白在不消耗能量的情况下，通过核心亚基BamA自身β-桶的侧向打开，利用BamA第一根β-片层与底物OMP的最后一根β-片层（信号肽）相互作用，启动外膜蛋白折叠的动态分子模型。前期的研究揭示了BAM整合底物的初始阶段，而有关BAM如何完成底物β-桶的折叠、关闭及释放的分子机制尚不清楚。
2023年4月26日，浙江大学上海高等研究院周如鸿教授团队、浙江大学医学院张兴团队及四川大学华西医学院董浩浩团队在Nature上发表题为 “Structural basis of BAM-mediated outer membrane β-barrel protein assembly”的研究论文，首次捕捉到了BAM与底物β-桶蛋白EspP在外膜折叠整合过程中的多个中间态构象，同时通过体内外功能分析及全原子分子动力学模拟揭示了底物OMP的组装、关闭及释放的全过程，为以此蛋白复合物为靶点的新型抗菌药物研发提供重要科学依据。
由于BAM在体内组装底物的过程很快，因此捕获BAM整合底物的中间复合物具有极高的挑战性。研究团队通过在BAM与EspP预测的互作区域引入不同位置的半胱氨酸使其在体内自发形成双硫键的策略成功获得BAM-EspP复合体蛋白。研究团队通过单颗粒冷冻电镜技术首次解析了BAM-EspP的多种构象，包括双桶打开（open state）、预关闭（ready-to-close state）、半关闭（semi-closed state）和全关闭（full-closed state）的四个状态的高分辨率三维结构，展示出BAM在组装底物OMP的完整动态变化过程，阐明了BAM对于EspP的识别、整合及释放的工作机制（图1）。
图1.BAM-EspP的四个动态中间态冷冻电镜密度图与结构图
研究发现BAM的各结构域构象变化参与了诱发底物整合过程中各阶段的启动。在起始阶段，BamA β-桶N端BAM的β1链向外侧向打开，使初始EspP肽链C端作用于该链并作为模版协助折叠整合形成整张β-片层。在预备闭合和半闭合构象中，BamA桶状结构从外开(outward open)状态转变为内开(inward open)至内关(inward closed)状态，该构象变化可通过结合细胞膜张力对相连的底物β-片层施加内卷动力，使其向内弯卷成桶状结构，并利用类似拉链机制在β1与β12之间形成氢键关闭β-桶。与此同时，BamA β-桶的N端从与底物互作的界面逐渐剥离，允许各自β-桶启动关闭程序，直至双桶完全关闭并分离。通过折叠实验显示底物OMP β1与β12之间形成的所有氢键皆对于底物β桶结构的完整折叠与释放十分重要，但对于BamA-β1来说胞内端的氢键更为重要，有助底物识别和启动整个折叠程序。同时，BAM辅助亚基BamB-E与BamA的周质附件（POTRAs）在胞内形成周质环，在β桶关闭过程中，该周质环同时发生顺时针旋转，其中一些处于POTRA域的连接环随着构象改变与BamA-β桶或辅助亚基产生不同相互作用，推断是通过引起β桶N端构象变化，诱发双β桶关闭的启动诱因，从而提出BAM“旋转和闭合”机制，并支持早期提出的“旋转和入膜”的OMP折叠模型。
BamA属于OMP85蛋白超家族，参与从细菌外膜到人类线粒体乃至植物叶绿体外膜蛋白的组装，其对于β-桶组装功能在进化上是保守的，这表明这些蛋白具有共同的进化起源和折叠机制。该研究发现不仅为靶向耐药菌干预提供科学依据，同时对于理解真核细胞双膜细胞器线粒体和叶绿体中β-桶蛋白的保守折叠与整合机制具有重要的启发意义。
浙江大学上海高等研究院计算+生物团队陈骏为该论文的共同第一作者，浙江大学上海高等研究院院长周如鸿教授为共同通讯作者，浙江大学生命科学学院博士生谢腾参与了本工作。该研究得到了国家重点研发计划（2018YFA0507700,2021YFA1301900,2021YFA1301203,2017YFA0504803,2021YFA1201201,2021YFF1200404），国家自然科学基金（31900039,32000844,81971974,U1967217），国家生物药技术创新中心（NCTIB2022HS02010），中央高校基础研究基金（226-2022-00043,226-2022-00192），国家自主创新示范区上海张江重大项目（ZJZX2020014），浙江大学上海高等研究院繁星基金（SN-ZJU-SIAS-003/006/009），以及壁仞科技研究（BR-ZJU-SIAS-001）等资助。
周如鸿教授简介：周如鸿，AAAS Fellow, APS Fellow, 浙江大学求是讲席教授，浙江大学上海高等研究院院长，浙江大学生命科学学院院长。长期从事计算生物学、生物物理、生物化学与人工智能+等交叉学科的研究，在蛋白质设计、纳米药物设计、肿瘤免疫机制等领域取得了一系列国际领先的原创性成果。授权30余项国际专利，在Nature，Science，Cell等国际权威学术刊物发表论文300余篇 (其中 1篇 Cell，2篇 Nature，2篇 Science，19篇 Nature子刊，17篇 PNAS， 14篇 JACS)，文章总引用超过25000余次，H因子81 （Google Scholar）。近年来主要研究兴趣包括开发高性能计算与机器学习等新算法研究肿瘤免疫分子机制，高效抗肿瘤纳米药物，和生物大分子互作机理等。
原文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-023-05988-8
内容来源：Xmol
